支原体检测方法-PCR 法

PCR 法是20 世纪80 年代中期建立起来的一种体外DNA 扩增实验，其基本原理是酶促DNA 合成反应，即在DNA 模板、引物和脱氧核糖核酸存在下，经DNA 聚合酶的作用，使DNA 链扩增延伸。该实验具有灵敏度高、特异性强、检测快速的特点，但其对实验环境要求严格， 实验成本较高， 有时还会出现假阳性的现象。

（一）材料与设备

支原体PCR 检测试剂盒、dNTP 、TaqDNA 聚合酶、缓冲溶液、琼脂糖、矿物油、超净工作台、PCR 仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、台式离心机、旋涡混旋器等。

（二）操作步骤

1 样品的收集。待测细胞用无双抗培养液培养7d，用无菌容器取上清液500μl ,4℃ 保存待测。
2 . 模板的制作。在无菌的条件下， 取细胞培养上清1 00μl 于一无菌的0.5ml塑料离心管内，盖好盖子， 95 ℃ 水浴加热5min 。
3. 打开盖子，向管内加StrataClean Resin 10μl，盖好盖子，旋涡混悬器混合，离心5~ 10s, 吸取上清至一新的塑料离心管中，模板制作完毕， 4℃ 保存。
4. PCR 反应。反应体系的最适条件为10mmol/L Tris-HCI (pH 8.38), 50 mmol/L KCI, 1.5~ 2.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP, 2U Taq DNA 聚合酶，总反应体系为50μl ， 反应用去离子水均需用紫外灯照射。
（1）在0.5ml 塑料离心管中加入35.2μl 去离子水及5μl 10 xTaq 反应缓冲溶液。
（2）依次加入下列成分： 0.4μl dNTP (25mmol/L）、0.4μl Taq 酶(5U/μl ) 、2μl引物。
（3） 加2μl 去离子水， 总体积45μl 。
（4）加5μl 己制成的模板到反应体系中。
（5） 阳性对照，内对照各5μl 加入到各自的反应体系中。
（6） 取1支含有以上反应体系的离心管，加入5μl 去离子水作为阴性对照管。
（7） 在反应体系中加入100μl 矿物油。
（8）PCR 程序见表1 。

5.琼脂糖凝胶电泳。PCR 反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为2%。电泳结束后，凝胶成像分析结果。

6.结果分析。该方法为检浏支原体的定性方法，在电泳泳道上， Marker、阳性对照、内对照均会出现不同的电泳条带， 当被检样品泳道出现明亮条带，且位置在阳性对照和内对照条带位置之间，即可认为该样品被支原体污染 。
有时还会发现一条泳道出现多条，可能是该样品感染2 种以上支原体所致。如果泳道内条带隐约出现，则可怀疑有支原体污染，重做该样品。

（三）注意事项

1、PCR 反应的前期操作应在无菌环境中进行。

2、注意假阳性、假阴性，有时需多次重复