支原体检测【PCR法】

一、支原体简介

支原体是细胞外生存的最小微生物，最小直径仅0.2um，大小介于细菌和病毒之间，是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状，分枝状等多种态。它不同于细菌，也不同于病毒，种类繁多，分布广泛，造成的危害相当大，涉及人、动物、植物及昆虫等多个领域，给人类健康和科研工作带来不利影响。从人体分离的16种支原体中，5种对人有致病性，即肺炎支原体、解脲支原体、人型支原体，生殖支原体及发酵支脲解支原体属含脲解支原体等体、脲解支原体及人型支原体等对人有致病性。由于支原体形态多变，在光境下不易看清内部结构。电镜下观察支原体膜为三层结构。其中央有电干密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间，横断面与细胞微绒毛相似，但微绒毛电子密度比支原体小，且中央无颗粒群或中央束。

支原体因为个头小，能穿过0.22 um滤器，并且在实验室内会潜在的扩散。支原体污染细胞后，培养液不一定会发生混浊。多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解，因此易被忽视。但个别严重者，可致细胞增殖缓慢，甚至从培养器皿脱落。所以支原体感染会使培养的细胞慢慢枯萎，使得用被污染的细胞样本做的实验完全失去意义和价值。因此，有必要对新引进的细胞和实验过程中的细胞株进行支原体检测。

二、PCR法支原体检测实验原理

原核生物的rRNA碱基序列非常保守，而rRNA操纵子上编码rRNA的DNA间隔区如16S和23S间隔区，各种生物种间的碱基序列差别很大。这个间隔区的 DNA 序列在支原体各个种间既有相对保守的部分，也有具有很大差异的部分。因此我们针对编码 16S和23S rRNA的DNA上设计一对F1/R1引物，扩增编码16S和23S rRNA的DNA间隔区。此反应体系只特异性扩增支原体DNA，检出灵敏度与特异性都很高。

三、PCR法支原体检测实验相关内容

（一）实验样本和仪器试剂

实验样本：用于检测支原体的样品是接种后进行 3-6 天细胞培养的培养上清液。如果使用常用的细胞培养基，培养上清可直接加入到 PCR 反应液中。如果使用细胞悬浊液作为样品，则需要提取 DNA，再进行 PCR 反应。

主要仪器与试剂：PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪。

（二）方法

1.引物特异性展示

以下是NCBI引物特异性Blast部分结果。（点击图片放大 查看详细内容）

由此可见，该引物能检测绝大部分支原体，有良好的的特异性。

2.支原体检测引物

F：ACACCATGGGAGCTGGTAAT

R：CTTCTTCGACTTCCAGACCCAAGGCAT

3.实验步骤

（1）将合成的引物稀释成终浓度为100 nmol/L的储藏液与10 nmol/L的工作液。

（2）按以下组份配制PCR预混液：

（3）向以上反应混合液中加入检测样品（5ul以下），使总体积达到50ul。添加样本时应防止交叉污染。

（4）把反应管放入PCR仪中，设定以下条件，进行PCR反应：

PCR的检测下限是M. capricolum 1ng， M. hyopneumoniae和U. urealyticum 100pg、其他的Mycoplasma是10pg。但是Human DNA、Mouse DNA在100 ng时有非特异性片段扩增。

（5）预先配置好1~1.5%的琼脂糖胶，将完成的PCR反应液依次加入到胶孔中并选择合适的Marker进行琼脂糖凝胶电泳。

（三）、实验结果和数据

1.支原体检测结果

实验跑胶图如下：

2.结论

经鉴定，样本1支原体检测结果为阴性。

经鉴定，样本2支原体检测结果为弱阳性。

经鉴定，样本3支原体检测结果为阳性。