HLA分型技术

HLA分型技术
主要组织相容性复合物（MHC）是脊椎动物体内最复杂且具有高度多态性的基因群。1984年George Snell 首次发现小鼠MHC即H－2，1958年Dausset 发现了人的MHC即HLA基因。MHC的表达产物称为主要组织相容性抗原，MHC抗原是有核细胞表面膜蛋白分子，对抗原递呈和免疫信号传递起关键作用。

HLA基因，位于6号染色体上短臂上，长约4000Kb。HLA是目前所知人体最复杂的遗传多态性系统，有几十个基因座位，每个基因座位又有几十个等位基因，且呈共显性表达。由于MHC基因位于同一条染色体上，其多基因座位上的基因型组合相对稳定，很少发生同源染色体间交换，这就构成了以单元型（HAPLOTYPE，即在同一条染色体上紧密连锁的一系列等位基因的特殊组合）为特征的遗传。按中国人常见的A座位基因有13个，B座位基因有30个计算，可组成的单元型约有13×30＝390种之多。理论上估计，父母各给一串单元型给子女，便会形成4.3万种HLA－AB血型。事实上，HLA 各基因并非完全随机地槌傻ピ?停??浅氏殖隽??黄胶猓╨inkage disequilibrium,LD）的特点。理论推测的HLA 分型数量巨大，但对一个具体的民族来说并非如此。世界上各个民族人群的HLA多态性和单元型都有各自的特点。总体来讲，中国北方汉族、北美白人和北美黑人人群的多态性较中国南方汉族和日本人群丰富。即使在中国，地区间也存在差异。在中国汉族群体中抗原A1、A3、B13、B44和B51频率呈北高南低分布，而抗原A24、B46、B60呈北低南高分布。在中国汉族群体中常见的A30-B13-DRB1*07，A1-B37-DRB1*10单体型频率呈北高南低分布，在江浙沪汉族人群中频率较北方汉族人群下降，而A2-B46-DRB1*09，A33-B58-DRB1*17，A33-B58- DRB1*13单体型频率呈北低南高分布。HLA多态性程度可见一斑。

HLA研究涉及免疫学、生物学、遗传学、分子生物学、医学等多个学科，并已发展成为一个独立的学科分支。迄今HLA研究已达到相当深入的水平，并在诸多方面取得显著进展，包括HLA复合体结构；HLA分子结构及其表达的调控；HLA分子功能，尤其是在抗原处理、呈递及T细胞识别中的作用；HLA的DNA分型及多态性研究；HLA与疾病的关系；HLA与移植的关系等。HLA研究不仅使器官移植成为一种极有价值的治疗手段，并给基础与临床免疫带来了突破性进展。已经证实，HLA复合体中存在控制免疫应答的基因以及HLA参与约束免疫细胞间相互作用，这表示HLA涉及生命活动的各个水平与多个方面。可以预期，对HLA的研究将继续成为免疫遗传学最活跃的部分；对HLA的应用将扩展到基础、临床、预防医学的各个领域。

纵观HLA系统的研究过程，其发展无不与技术的手段的突破与运用有密切关系。70年代到80年代末期主要是血清学研究；90年代以来，HLA进入了分子水平研究阶段，进展尤为显著。HLA分型技术同样走过了这一历程。建立于60年代并不断完善的血清学及细胞学分型技术主要侧重于分析HLA产物特异性。

血清学分型借助的是微量淋巴细胞毒试验（microlymphocytotoxicitytest）或称补体依赖的细胞毒试验（complement dependent cytotoxicity test，CDC）。取已知HLA抗血清加入待测外周血淋巴细胞，作用后加入兔补体，充分作用后加入染料，，着染的细胞为死亡细胞，依据特异性抗体介导的补体系统对靶细胞溶解的原理，待检淋巴细胞表面具有已知抗血清所针对的抗原。血清学分型存在诸多缺点：①标准分型抗体亲和力较弱、效价较低、易产生交叉反应，②缺少某些单价抗血清；③某些病理过程可能导致外周血淋巴细胞表面抗原性质发生改变．干扰抗原—抗体反应；④国内供HLA—I类抗原分型的血清板来源困难、质量欠佳。上述因素均严重影响了HLA分型结果的可靠性及该技术的推广应用。

细胞学分型技术指的是通过纯合分型细胞（homozygote typing cell,HTC）及预致敏淋巴细胞试验（primed lymphocyte test,PLT）对HLA分型。二种方法的基本原理均是判断淋巴细胞在识别非己HLA抗原决定簇后发生的增殖反应。由于分型细胞来源困难以及操作手续繁琐，细胞学分型技术下正逐渐淘汰。

1991年第11届国际HLA专题讨论上提出了HLA的DNA分型方法，这类方法近年来在研究和应用方面发展非常快，有取代其他方法的趋势。DNA分型方法主要分为两种：基于核酸序列识别的方法和基于序列分子构型的方法。下面简要的阐述各方法的原理和优缺点。

基于核酸序列识别的方法主要有：PCR-RFLP,PCR-SSO,PCR-SSP和PCR-SBT。

PCR-RFLP：其原理是将目的基因片段PCR扩增后，利用多种限制性内切酶对扩增产物进行酶切，不同的基因序列会产生不同的酶切产物，从而产生不同的电泳图谱。它以其简单、敏感、准确，无需同位素等优点成为目前较常用的HLA基因分型技术之一，但是无法分辨杂合子，且只能区分有限的多态性。

PCR-SSO（sequence specific oligonucleotide）：也称PCR-ASO（allele specific oligonuceotide）。用以同位素或非放射性标记的探针与PCR扩增的目标片断产物杂交，根据阳性斑点判断个体基因型。由于HLA等位基因非常多，就需要很多的探针对每个DNA样品要进行多次杂交（甚至十几次）才能完成定型分析操作也十分繁琐。于是在此基础上又发展起来一种反向杂交法（reverse hybridization）。将各种不同的探针固定于同一张膜上，再将PCR产物标记，以PCR产物（待检测基因DNA）反过来与探针杂交。这样一次杂交即可完成多个等位基因分析。此方法具有灵敏度、特异性强、需样本量少等优点，但不同探针的杂交条件的须严格统一（如温度，离子强度）, 易出现误差;不能检测新等位基因，试剂盒需不断升级; 对某些杂合子分辨率也不好;。很多HLA基因型含有相同的多态性，而仅仅由于排列方式不同，因此分辨率不及SSP和SBT（4.01＃113）。此方法适宜大量和高纯度样本，杂交条带将作为书面原始记录长期保存（三种效果比较）。

PCR-SSP：上述的PCR/RFLP、PCR/SSO等，最终均需用标记的特性探针与扩增产物进行杂交，再分析结果。PCR/SSP方法用乃设计出一整套等位基因组特异性引物（sequence specific primer,SSP），借助PCR技术获得HLA型别特异的扩增产物，可通过电泳直接分析带型决定HLA型别，从而大大简化了实验步骤。优点是简单易行, 分辨率可从低到高, 成本低。缺点是不易自动化;不能检测新的等位基因，试剂盒需不断升级。此方法适宜零散和纯度低样本，重复实验时要重提DNA和必须使用紫外凝胶成象仪保留原始资料，增加实验成本（三种效果比较）。PCR-SSP和PCR-SSO均需大量试剂（引物）,且不能识别非经典的HLA基因和假基因（绿）。针对HLA外显子和内含子序列精心设计引物可避免这些问题。

PCR-SBT: 以PCR扩增所要分析的基因片断，然后对DNA序列进行分析，可以直接得到基因型。分辨率高，可大规模进行，精确度高，能直接发现新的等位基因。但是由于杂合子的存在，无法分辨单元型。

以上各个方法都存在无法克服的缺陷，如能配合使用，则能大大提高分型能力。国外有学者对60个样本进行研究，发现单用SBT，只有18％的样本能将A，B位点同时分型成功，如结合SSO，则能将所有样本成功分型。

基于核酸序列识别的分型方法始终无法越过杂合子的难关。HSE(Haplotype-specific extention)技术完美地解决了这一问题。它是利用磁珠与其中一条同源染色体的特异位点结合，达到分离同源染色体的目的，杂合子问题不攻自破。因此，HSE无论与SSO还是SBT结合使用，都有极好的效果（1.01＃12，4.01＃94）。

近年来，测序新技术发展层出不穷，纷纷运用到HLA分型中。如MSNE(multiplex single nucleaotide extention),应用链中止法原理，根据等位基因SNP位点设计特异性引物和生物素荧光标记的ddNTP进行分型，有重复性好，可分辨杂合子等优点，已应用到A位点的分型中。（4.01＃93）又如pyrosequencing 法分型，分辨率好，可分辨杂合子，自动化程度也高。DNA芯片技术，作为一项检测SNP的成熟技术，也已应用到HLA 分型中.

基于序列分子构型的分型方法在理论上就避开了杂合子这个难题。SSCP(PCR单链构象多态性分析，PCR-single strand conformational polymorphism)是最常用的根据构型的分型方法。扩增的目标产物变形后形成单链，不同的序列，甚至仅有一个碱基的差异，就会形成不同的茎环结构，从而电泳速率不同。但此方法仅限于分辨仅限于200－300bp（绿16），且即使是同一单链DNA在相同情况下也会形成不同的构型，使得电泳条带很难分析;也有可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小的情况,使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。

HA(异源二聚体电泳多态性，Heteroduplex Analysis)是另一种基于序列分子构型的分型方法，根据异源二聚体未配对区域的长度和分布而显示出电泳条带不同（绿18）。但与单链DNA相比，异源二聚体电泳条带过于复杂，难以分析。

新发展的RSCA（Reference Strand Mediated Conformation Analysis）技术根据HA的原理，设计了位点特异性荧光标记的参照DNA片段，与样本DNA分子的正反链形成异源二聚体.带有荧光标记的电泳条带易于分析，能够克服HA的不足。

另外，提取基因组模板的技术也在不断发展。用于分型的DNA来源也已不局限于血液，口腔涂片、唾液中提取的DNA也有相似的效果（7.01＃261）。针对微量基因组模板的情况，现已开发出基于滚环复制的全基因组扩增技术，可以将1ng的模板扩大至100ng，足以应付PCR-RFLP、PCR-SBT等分型技术的要求。