端粒酶活性检测方法的研究进展

      摘要: 近几年 研究 表明端粒酶与肿瘤的发生 发展 密切相关，推测可能是一个广泛的肿瘤标志物。本文就端粒酶活性检测的原理，端粒酶的提取 方法 ，trap扩增技术，四种结果 分析 方法（同位素法、染色法、荧光法和elisa法）以及如何进行质量控制与半定量测定进行综述。

       端粒酶（telomerase）是由rna和蛋白质组成的一种核糖核蛋白酶。人端粒酶rna组分（htr）于1995年被克隆，其中含有端粒重复序列的模板（5′-cuaacccuaac-3′）；蛋白质组分具有rna依赖的dna多聚酶活性，结构尚不清楚。端粒酶能以自身rna的模板区为模板复制合成端粒序列。在胚性细胞等增殖活跃的细胞中具有端粒酶活性，而在正常成熟体细胞中端粒酶失活，同时还发现绝大多数肿瘤细胞都呈端粒酶阳性，而在癌旁组织和正常组织阳性率很低，推测端粒酶可能是一个广泛的肿瘤标志物[1]。因此近几年端粒酶在各种肿瘤中的研究日益深入，同时促进了检测方法的改进与完善。本文对其检测方法综述如下。

      1 基本原理

       端粒酶在体外可以以其自身rna的模板区为模板，在适宜的寡核苷酸链的末端添加6个碱基的重复序列，用聚丙烯酰胺（page）凝胶电泳可显示6个碱基差异的梯带。1994年kim建立了基于pcr基础上的端粒重复序列扩增法（telomeric repeat amplification protocol, trap）。trap反应原理见下图。

       首先合成一个18nt的ts做上游引物，端粒酶结合ts末端的gtt并合成agggttag，然后每经过一次转位合成一个ggttag的6碱基重复序列，端粒酶灭活后，加入一个24nt的cx做下游引物，经过多次变性-退火-延伸，扩增端粒酶延伸产物。

      2 基本技术方法

      2.1 标本来源 手术摘除组织，针吸活检组织，胸水，腹水，膀胱或胰管冲洗液，棉拭子所取分泌物和尿液（尚有争议）等。

      2.2 引物设计 为了防止上、下游引物之间的结合，在cx引物上设计了3个不匹配碱基（见图1*处），单链结合蛋白t4基因32蛋白可进一步避免引物之间的结合，ts和cx引物被广为采用，在上述条件下，只有延伸了三至更多的ggttag片断才有特异扩增，即得到从40bp开始的6bp差异的梯带。broccoli等以5′-ggcgcg(acccta)3-3′代替cx引物，由于增加了g-c含量，可提高退火温度，进一步避免引物间的结合，增加特异性[3]。oncor公司设计rp引物代替cx引物，得到从50bp开始的6bp差异的梯带[4]。

      3 扩增片断的检测

      3.1 同位素法 kim建立的方法即为同位素法，其 应用 最多。采用[α-32p]dgtp或dctp掺入的报道很多，但部分学者用[γ-32p]datp和t4激酶标记ts引物的5′端，发现更易于检出低水平的端粒酶，同时更易定量。page凝胶电泳后在x-光片上放射自显影或用phosphoimager仪扫描测定3h。同位素法的优点是灵敏度高，100个永生化细胞27个循环即可检出，缺点是存在放射性污染，且放射自显影需8h至两天以上时间，时间较长。

      3.2 染色法 电泳后用sybr green或eb染色，然后紫外灯下观察或用ccd图像系统测定。eb在302nm紫外透射仪和桔红色紫外滤光片下效果最好，可得与sybr green相近的敏感性。染色法简便，快速，灵敏度为100个永生化细胞30个循环，由于染色带的信号强度不能精确反映其分子数（大片断染色更强），因此染色法只能判定相对端粒酶活性，而不能测定端粒酶延伸产物的确切数量。

      3.3 荧光法 加入10pmol荧光素标记（如fam，fitc）的ts和/或cx引物扩增，经8％的变性page凝胶电泳，dna测序仪自动读取数值，片断管理系统软件自动 计算 扫描曲线的峰高和峰面积，从上样到出结果仅需90min。荧光系统极敏感，为避免过量扩增产物可能给出不可靠结果，要使用0.5～1.0μg的低蛋白量，扩增27个循环，由于片断管理系统能自动检出很微弱的荧光，因此不能精确测定低水平端粒酶活性[8～11]。荧光法的另一应用是于原位—trap分析，可以在细胞水平上检出端粒酶活性，因此可以判定是哪些细胞、多少细胞具有端粒酶活性，而裂解提取法不能知其活性的细胞来源。原位分析在硅化玻片上进行，荧光显微镜下观察结果。 目前 只用于新鲜标本，用冻存病理标本的实验尚不成功，需改进方法防止冻融中胞内端粒酶的分散及增加标本的渗透性等。

       3.4 elisa法 ts引物5′端标以生物素，pcr扩增后，将产物变性，加入地高辛标记的可与扩增产物的重复片断特异结合的探针，杂交产物上的生物素与固定在微孔板上的卵白素相结合，而探针上的地高辛与过氧化物酶标记的抗地高辛抗体结合，然后加入底物，显色后用酶标仪测定。elisa法是宝灵曼试剂盒使用的方法，由于没有电泳，因此观察不到6bp差异的梯带。

       4 质量控制

      4.1 排除假阳性 设置以下四种对照（1）85℃10min灭活端粒酶；（2）端粒酶对rn ase敏感，0.5μg/10μl提取液＋1μgrnase，37℃，20min；（3）不加提取液；（4）不加cx或ts引物。以上实验可排除引物二聚体或pcr污染。

       5 端粒酶活性的半定量检测

      5 小结

       kim建立了trap方法为端粒酶活性的检测提供了一个有力的手段，此后许多学者又进行了改进，尤其是内标的引入使得借助某些分析仪可以进行较精确的半定量测定。四种结果分析方法中，同位素法灵敏度高，但存在放射性污染，临床推广有一定难度；荧光法虽需进口的贵重仪器，但其敏感、快速、自动化程度最高，且易于半定量；染色法和elisa法简便、快速，结合稀释法可以进行简单的半定量，后三种方法均有应用前景。