端粒酶活性检测
我公司采用的荧光TRAP+CE检测方法,较之传统的TRAP法,提升了检测效率(3-5h),结果判读更加自动化和标准化,且检测灵敏度也有明显的提升(可检出个位数级细胞)。
一、服务简介
端粒酶(Telomerase)是由RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白酶。人端粒酶RNA组分(hTR)于1995年被克隆,其中含有端粒重复序列的模板(5’-CUAACCCUAAC-3’);蛋白质组分具有RNA依赖的DNA多聚酶活性。端粒酶能以自身RNA为模板复制合成端粒序列,端粒DNA是一系列重复的富含G的DNA序列,这一序列在生物进化中具有高度的保守型(-TTAGGG-),端粒在保护基因组DNA不被降解、防止染色体有害变异(染色体末端融合、重排、移位和缺失等)起重要作用)。端粒酶的功能包括添加端粒重复序列,端粒长度的稳定和维持,以及染色体的整体空间取向、结构完整性和稳定性。
在胚性细胞等增殖活跃的细胞中具有端粒酶活性,而在正常成熟体细胞中端粒酶失活,同时还发现绝大多数永生性细胞株和肿瘤细胞株都呈端粒酶阳性,而在癌旁组织和正常组织中阳性率则很低,推测端粒酶可能是一个广泛的肿瘤标志物,端粒酶反应超越了细胞的增殖限制,这可能是恶性肿瘤发生的一个先决条件。
传统的端粒酶研究方法是以探针延伸为基础测定端粒酶活性,需要大量的样品材料,且检验灵敏度受限,直到1994 年kim等采用端粒重复扩增法(Telomeric Repeat Amplification Protocol,TRAP)所取代。标准的TRAP法检测是通过PCR扩增端粒酶反应的产物,使用放射性标记,经凝胶电泳后,通过放射自显影显示检测结果。该方法相较于传统的方法,检测灵敏度有所提升,然而在检测环节仍然操作繁琐,且结果判读存在主观性。
我公司采用的CELL STR ID®端粒酶TRAP+CE检测方法,提升了检测效率(全流程:4-6h),结果判读更加自动化和标准化,且检测灵敏度也有大幅度地提升。
二、服务内容
(一)服务流程
(二)服务特点
1.取适量蛋白提取物,参照TRAP 法,对端粒酶底物进行扩增,扩增产物在ABI 3130XL 型遗传分析仪上进行毛细管电泳检测和分析。
2.灵敏度高。检测线为皮克级:30pg/μL。
3.鉴定报告中文版,以及图谱(见端粒酶检测图谱)。
(三)注意事项
1.样品寄送:细胞数量≥106个,1.5ml离心管;干冰运输。
2.正常检测周期5-7个工作日。
(四)结果交付
检测结果以电子版的形式发放到订单或合同上面预留的邮箱,书面报告可根据需要随时提供,寄送到贵单位。
三、检测端粒酶活性的常用方法:
1、直接检测端粒酶(蛋白及RNA的结合复合物)的活性,检测它是否可以延伸RNA模板,然后跑胶或者探针杂交,检测端粒cDNA延伸的长度,以此来判断端粒酶的活性高低。(TRAP法)
不足:经典方法,但该方法需要放射性同位素标记及制胶;重复性差、周期长、主观判读等。
2、间接检测端粒酶组分(催化亚基的mRNA量)的表达量。
不足:本质是检测端粒酶的一个组分蛋白TERT的mRNA的表达量, 但是在多数细胞中,端粒酶催化亚基的表达很难检测到,且mRNA的表达量并不一定能准确反映端粒酶的活性强度,因端粒酶是一种由RNA及多种蛋白组成的复合物,TERT酶只是其中较为主要的一种蛋白。
四、北京美德华生端粒酶检测(TRAP+CE)流程:
1 样本处理:端粒酶提取试剂盒,按照操作说明书,取适量细胞提取蛋白。-80°保存待用。
2 端粒扩增:端粒酶扩增试剂盒,按照操作说明,扩增端粒重复序列。
3 端粒序列检测:毛细管电泳检测,按照操作说明进行检测。
4 端粒扩增产物结果分析: 按照SOP进行数据分析。
5 报告整理:
五、相关文献:
1. Telomeres and telomerase: three decades of progress JW Shay, WE Wright - Nature Reviews Genetics, 2019 - nature.com
2. Alternative lengthening of telomeres: Models, mechanisms and implications. Nat Rev Genet. 11:319–330. 2010. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
3. Telomerase activity concentrates in the mitotically active segments of human hair follicles. J Invest Dermatol. 108:113–117. 1997. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
4. Detection of telomerase activity in human cells and tumors by a telomeric repeat amplification protocol (TRAP) Methods in Cell Science 17: 1-15, 1995
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