DNA条形码技术在真菌上的研究与应用

      DNA条形码技术（DNA barcoding）是通过一个或多个保守基因在各个物种间进行大范围的扫描，进而识别和鉴定物种或者发现新物种的技术。传统分类学通过对物种进行描述和鉴定，完善并形成一套完整体系的信息检索系统，成功鉴定出170多万种生物。随着生命科学的发展，尤其是新兴的PCR技术、遗传分子学、高通量测序技术、生物信息学等新领域的出现，应运而生的DNA条形码技术不受生物生长时期形态学特征的干扰，能客观准确地将物种区分并鉴定。因此，建立一个基于标准分子序列的物种鉴定系统成为全世界科学家们的宏伟计划。然而，DNA条形码计划是一项需要分类学、信息学、软件处理、硬件研发、设备更新等方面协同作战的系统工程。本文就DNA条形码技术在真菌上的研究与应用进行探讨，对有效开展真菌的鉴定分类、监测检疫、多样性保护等具有重要意义。    

      1 DNA条形码的起源与发展   

      DNA条形码概念起源于2003年在美国冷泉港由Alfred Sloan基金会主办的DNA条形码科学性和社会功能研讨会。其被Hebert博士首次提出，即利用线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因（Cytochrome c oxidase subunit I， COI）的一段特殊区域作为DNA条形码的基础序列，通过比较不同物种间该段序列间的差异进行物种鉴定。该概念的提出受到了科学界的重视，因为它可准确地将刺胞动物门（Cnidaria）外的共计11个门的13 320个个体逐一鉴别。如同商品条形码使用扫描仪就能识别条形码信息一样，将DNA条形码与数据库中已知的条形码进行比对，即可鉴别出具体的类别。会议提出了国际DNA条形码计划（International barcode of life project，iBOL）。2004年在美国华盛顿国家自然历史博物馆创立了生命条形码联盟（Consortium for the barcode of life，CBOL）。随后10年，iBOL在世界各地举办了5次国际生命条形码会议。2005年2月，由CBOL和英国自然历史博物馆主办的生命条形码协会，在伦敦召开第一次国际会议，讨论决定为1 000万物种建立条形编码库。2007年9月在台北市召开了第二次国际会议，同年5月，加拿大圭尔夫大学（University of Guelph）成立世界上首个DNA条形码鉴定中心，同时开始了生命条形码数据库系统（Barcode of Life Data Systems，BOLD）的筹建工作。该系统将与NCBI、DDBJ、EMBL等数据库进行数据共享，整合已有物种的条形码序列信息，建立一个全球共享的物种鉴定DNA条形码系统。2009年11月，在墨西哥召开第三次国际会议，CBOL 提出植物DNA条形码的标准片段将由rbcL和matK两条基因共同使用来实现，同时不同类群的植物要求选配其他基因来提高物种的分辨率。2011年在澳大利亚举行第四次国际DNA条形码会议，专题讨论了理想条形码的选择和确定问题。2013年10月第五次国际DNA条形码会议在中国昆明市举办，会议提出加强国际物种数据资源交流共享，建立统一的技术标准和操作方法，推进DNA条形码技术和生物多样性科学发展，这5次会议对在全球推进DNA条形码计划起到了至关重要的作用。   

      随着研究的开展，DNA条形码在鸟类、鱼类、节肢动物、软体动物、基础昆虫学和应用昆虫学中都得到广泛的应用，甚至可以对同一物种的不同形态进行鉴别，例如不同发育阶段、种群内物种等级、复合物种等。在植物研究方面，叶绿体基因片段rbcL和matK被确认作为植物DNA标准条形码的核心码，叶绿体基因片段trnH-psbA和核基因片段ITS作为补充码。与动物、植物的DNA条形码研究进展比较而言，菌物DNA条形码技术的研究进展相对缓慢，目前仍处于寻找适合的目的基因片段并对其进行调试的阶段。  

      2 DNA条形码技术在真菌研究中的现状

      真菌是独立存在的真核生物，该数量仅次于昆虫，约有150万种。Micheli（1972）在《植物新属》中发表了真菌分属检索表并命名了他用显微镜观察到的真菌Aspergillus Clathrus Geaster Mucor Polyporus和Tuber。随后，越来越多的真菌被发现，由于真菌形态简单，有许多真菌难以通过离体培养方法获得，部分真菌的离体培养物只有菌丝体，不产生有性或无性孢子，因此由形态特征进行菌种鉴定面临着很大的挑战，而以分子生物学为基础的DNA条形码技术对真菌物种的检测与鉴定具有更重大的意义和应用前景。为此，iBOL特别成立了真菌独立工作组，并建立了国际真菌条形码专业委员会（International Subcommission on Fungal Barcoding），负责iBOL计划中与真菌有关的研究工作。DNA条形码的核心问题是标准片段的确定，人们最先将焦点放在对真菌中单一片段的筛选研究，涉及了细胞色素C氧化酶第一亚基COI和第二亚基CO基因核糖体基因中的ITS序列。随后β-tubulin、ND6、LUS、SSU等基因纷纷被发掘作为真菌鉴定的DNA条形码。   

      2.1 DNA条形码COI   

      COI作为最早被提出的生物DNA条形码，成功地在鱼类、昆虫上运用，所以真菌学家也对其在真菌中进行了大量的试验。Seifert等利用青霉属Penicillium Link的58个种和12个近缘种为材料进行研究，结果表明，COI片段的种内基因序列平均变异率小于ITS和微管蛋白（β-tubulin），为0.06%，种间平均变异率为5.6%;使青霉亚属的物种分辨率达到66%，优于ITS（-25%），但小于β-tubulin（-80%）基本可以选作青霉亚属物种的DNA条形码的基础序列。以此为基础，Chen等以COI为条形码技术，成功对70份环境样品中青霉属物种进行鉴定。Nguyen等对分别来自美国和南非的Leohumicola N.L. Nickerson，Hambleton和Seifert属下面的3个新种进行分子鉴定，发现COI与ITS 片段具有相同的效果。然而，Geiser等通过对56种真菌和卵菌的COI基因分析，发现在真菌界的壶菌门Chytridiomycota、接合菌门Zygomycota、担子菌门Basidiomycota和子囊菌门Ascomycota的绝大多数类群中都含有长度（134bp～3.1kb）和数量（1～7）不等的内含子，由于内含子的存在，使得已有的序列中由于缺少保守区而影响引物的设计，并干扰PCR扩增，COI不适合作为这些菌类的DNA条形码;Gilmore等以镰刀菌属Fusarium为材料进行研究得到的结果一致，内含子出现在目标条形码的中间增加了目的片段序列的扩增难度，COI基因很难成为该类群的DNA条形码。因此，在筛选特定真菌类群的DNA条形码候选基因时，应排除内含子的区域干扰。而同样的COI条形码，在卵菌纲 Oomycetes中，因为没有内含子干扰，可以有效地鉴别出不同物种，因此 COI 基因可以成为卵菌类群中理想的DNA条形码。因此，COI在真菌某些属种中具有很好的条形码功能，而很多属种由于COI基因的变异度太大，内含子太多，而导致COI的使用受到限制。   

      2.2 DNA条形码ITS

      经过多年研究的积累，NCBI上保存了接近172万条ITS全长序列，其中56%序列标有拉丁命名，涵盖15 000个种，2 500个属。White等扩增真菌核内核糖体RNA基因时首先设计ITS引物，随后ITS序列分析技术常被用作真菌的遗传距离的测定，另外许多真菌类群的系统发育也利用ITS序列来计算。许多真菌学家在尝试COI的同时，提出ITS也是非常符合的基础序列，并在很多种属上进行验证。接合菌方面，Schwarz等分析了毛霉目Mucorales中16个种（54株菌）的ITS序列，结果表明除近缘种外ITS可以将其他种类区分开。担子菌方面，ITS可以准确地区分欧洲的鹅膏属Amanita Dill. ex Boehm.的36个种和丝膜菌Cortinarius ser. Callochroi Bidaud，Moinne-Locc.和Reumaux组的79 个种;锈菌方面，ITS可以较为准确地区分开Chrysomyxa Unger属（10种）的90%和Melampsora Castagne属（5种）的80%种类。而在地衣型子囊菌方面，96.3% 的标本可以通过ITS准确鉴定到种。此外，ITS 可作为外生菌根真菌DNA条形码，通过传统和高通量的DNA测序技术，可以准确应用在外生菌根真菌物种多样性的检测与鉴定中。同时对不产孢内生真菌的鉴定，常规的形态鉴定以无性孢子及其产孢方式为依据进行，但是难度大、准确性不高，经过真菌ITS 序列种间变异率分析，大家普遍接受种间序列阀值为97% 的相似性。利用ITS 条形码通过DNA克隆和高通量测序技术可直接检测与鉴定植物体内内生真菌的物种多样性。ITS在真菌分类上起到非常重要的作用，并且由于其自身的序列小、种间变异率小、使用范围广等特点，在2011年第四届国际生命条形码大会上正式推荐为真菌的首选DNA条形码。随后，2012年12月在美国举办的真菌研讨会上，进一步确定了ITS作为真菌DNA条形码的研究任务，完善真菌ITS数据库的建设和数据整合，这对推动真菌DNA条形码研究与应用具有里程碑意义。

      2.3 其他新型真菌DNA条形码

      随着科学技术的不断发展，加之人们对于越来越多的真菌全基因组的认识，条形码的选取已不仅仅局限于常用的COI和ITS片段，一些新的条形码也在不断地被尝试和研究。 

      蛋白编码基因β-tubulin也被证实是一种有效的真菌DNA条形码，尤其是在子囊菌类β-tubulin 的分类效果要远远好于核糖体RNA基因。Samson等通过青霉亚属的180株菌株的β-tubulin序列分析，证实β-tubulin 基因是一种理想的物种标记。Zampieri等成功运用β-tubulin 基因鉴定了块菌属 Tuber P. Micheli ex F.H. Wigg.，并将β-tubulin开发成土壤块菌多样性监测的DNA条形码。在子囊菌亚门曲霉属中，β-tubulin被认为需要联合CAL（钙调蛋白）一起使用才是分辨率最好的 DNA条形码。然而，β-tubulin在地衣型真菌梅衣科Parmeliaceae和粪壳菌纲Sordariomycetes的类群分辨率极低，不能作为此类真菌的DNA条形码。因此，β-tubulin基因也只能作为真菌中部分种属的DNA条形码。  

      Santamaria等研究子囊菌的线粒体基因，发现不含内含子的特定区域包括完整的NADH脱氢酶亚基6（ND6）基因，此基因可为该菌群的DNA条形码。Robert等、Lewis等通过分析不同菌种的基因组，从中发现新的条形码序列 RPB2和EF1。核糖体大亚基（LUS）与ITS同为核糖体内序列，因ITS的广泛使用而被关注。目前在酵母菌属被确定为基础序列条形码，同时在球囊菌门也有着很好分辨率。在口蘑属方面，研究表明小核糖体亚基（SSU）中的V6和V9片段，有着较好的分辨率，同时V9片段也可以作为担子菌的条形码。Hajibabaei等提出微型DNA条形码的概念，由于常用的条形码的序列都有500 bp以上，在鲜活的样品中很容易获得，然而在很多加工和腐烂的样品中，很难获得完整的条形码序列，利用只有25 bp左右的微型条形码就能解决这一问题。这一概念的提出，很多科学家通过大量的分析获得了一些可以使用的微型DNA条形码。 

      曾昭清等以丛赤壳科13个属中的34个种为材料研究4种蛋白编码基因（Hsp90、AAC、CDC48和EF3）。结果表明，Hsp90和AAC基因虽然具有较高的PCR扩增与测序成功率，但种内、种间距离频率分布存在重叠，可能导致部分种的鉴定错误;CDC48基因可以恰当地区分种内与种间差异，但扩增与测序成功率相对较低;EF3基因的最大种内距离为1.79%，最小种间距离为3.19%，不存在种内、种间距离重叠，并具有较高的PCR扩增与测序成功率（96.3%），适合作为该科真菌的DNA条形码。   

     由于18S和28S基因过于保守，比ITS等基因的变异率低很多，不能适用大多数真菌类群的鉴定，目前只有异源细胞核复杂的球囊菌门利用它们作为DNA条形码。翻译延伸因子而EF1-α标记在镰刀菌属中鉴定分辨率比ITS更高，但在大部分真菌中扩增成功率太低而无法胜任真菌条形码。  

      越来越多的真菌DNA条形码被挖掘出来，但是目前仍没有一个能够达到ITS序列那样适用范围广、放大效果强的DNA条形码。因此，很多科学家都是在以ITS序列为基础条形码上，针对某些特殊的种属开发分辨率更加精细的DNA条形码。    

      3 存在的问题及展望 

      目前DNA条形码在真菌上的应用存在的问题：

      ①很难找到有绝对适应性的标准条形码，真菌的种属差异很大，总数庞大，基因序列的变异度大，很多通用的DNA条形码序列，被多个内含子干扰，给分子系统学鉴定带来了更多不确定的因素。

      ②由于真菌类群庞大，类群分离鉴定存在很大的困难，目前每个属种都是用部分具有代表性的菌株进行相关鉴定，获得效果很好的DNA条形码，扩大范围使用的时候效果也不是很好。因此更加系统地研究真菌的DNA条形码才更有说服力。

     ③DNA条形码的数据日益增多，国际上缺乏统一的数据系统和计算标准，导致物种鉴定时由于不同物种的变异范围不同，DNA条形码的计算标准也各不相同。    

      全球约有150万多种真菌，能命名的却只有10万种左右，巨大的鉴定工作，迫使人们努力地寻求新型快捷的鉴定技术。DNA条形码技术的出现无疑是给物种鉴定工作带来了曙光，极大地加快了物种鉴定的步伐。中国具有丰富真菌资源，尤其是热带亚热带地区更是全球瞩目的真菌生物多样性热点地区之一。大量的真菌材料需要人们进一步深入研究，结合目前的研究进展，要找到一段适合所有真菌的标准条形码难度很大，但是通过几个条形码的组合来逐渐缩小鉴定范围，对物种进行自动鉴定是可行的。尤其是高通量测序技术的出现，大量的真菌全基因组数据涌现，加速了真菌DNA条形码数据的积累，为真菌DNA条形码的应用提供了有力的技术支撑。更加快速、简便的真菌DNA条形码技术的应用，将在如下领域发挥作用：

      ①大量真菌菌株的筛选工作，加速新物种的发现;

      ②为进出口病原菌检疫、生物安全检验提供可靠、快速的技术支撑;

      ③为食品安全中病原菌监测提供灵敏、快速的监测方法;

      ④全面、准确、快速地进行环境真菌多样性检测，实现区域性、全球性真菌多样性环境监测网络。

     因此，DNA条形码技术的成熟利用和广泛推广，将在真菌资源、生物安全、食品安全、生态环境等领域起到更加重要的作用。