COI序列面临的问题

把COI 基因的部分序列定为动物DNA barcode的设想是基于一系列有关线粒体和物种历史的假设:

1)线粒体中现存的突变绝大多数是中性突变，线粒体基因组进化的历史基本上是中性和近中性的历史:

2)线粒体有足够的突变速度,而且这个速度大体稳定;

3)现存物种的形成时间大于某一个阈值;4)现存近缘种间不存在线粒体基因流。

另外， Hebert 等(2003a,2003b)在早期发展基于COI基因的 DNA barcode 方法时,持有这样的观念:物种的种内差异和种间差异之间存在易于辨认的界限，可作为辨别是否属于同一物种的标准。但是，这些假设和设想并非在所有情况下成立，正是这些例外引发了许多问题。

第1个问题来自 DNA barcode 设想最重要的基础。无 论 是 Hebert(2003a)，还是Tautz(2002，2003),虽然存在分歧,但是都同意2点:线粒体基因区别物种的原理都是近缘种间积累了足够的序列差异,主要是中性突变产生的差异;所能区别的近缘种最少分化时间计算很大程度上都是基于中性突变产生和固定的速度。尽管很多研究表明，大多数蛋白质(Endo et al.,1996),包括线粒体编码的肽段(Rand,2001)受强烈的负选择作用，反映到相应的DNA 序列上,表现为同义突变较多，非同义突变较少,通常基本符合中性突变的假设,但是 COI 等线粒体编码的基因在呼吸链上有重要作用,在热环境、动物新陈代谢特点等发生明显变化的时候正选择可能存在,例如,在某些海洋尖嘴鱼(billfish)中的研究表明,线粒体基因存在正选择(Dalziel et al.,2006)。在研究较为透彻的人类基因中，也发现了类似的现象,而且更加复杂。Mishmar 等(2003)检视了不同地区人类的线粒体基因,大致上非洲人中性突变较多,而亚洲人、欧洲人、西伯利亚人和美洲土著人明显受到了选择的作用，不同基因在不同的地区非同义突变的比例有显著区别:ATP6 基因在极地非同义突变较多，cvtb基因在温带非同义突变较多，CO1基因在热带非同义突变较多,他们认为,在不同地区不同基因受选择的作用明显不同。这些实验结果说明一个问题:DNA barcode 方法的基础可能并不是中性突变这么简单，COI 基因上某些序列的分歧可能也是适应不同小环境的结果。正选择的存在可能不仅仅是影响了对 DNA barcode 设想基础的理解，而且在操作中也许会出现一些问题:如果PCR扩增的序列正好包含了 COI 基因中受到正选择的序列，那么该物种与祖先的差别不仅仅是中性突变产生的差别,还要加上非中性突变的差异,那么计算所得的与祖先的分化时间很可能大于仅包含中性突变的序列。

第2个问题来自线粒体 DNA 的进化速率。如果进化速率太慢,COI 基因的序列差异可能未达到足以区分物种的程度。Hebert 等(2003b)在早期关于DNA Barcode 方法的研究中已经发现，无法用 COI 基因的序列差异来区分这些物种，推测的原因是腔肠动物的线粒体 DNA 进化太慢。更确切的例子在珊瑚虫中,研究表明,它们的线粒体DNA和日差异很小,甚至密码子第3碱基的摆动现象也不明显(Shearer et al. ,2002 )。

第3个问题也来自线粒体 DNA 的进化速率。不过这个问题是由特殊历史时间引起,例如,物种在严重污染,辐射的环境中暴露,导致 DNA 序列突变加快。尽管这样的事件在近代历史上发生过很多次,例如,比基尼岛上反反复复的核试验,但是对线粒体 DNA 改变速度的影响的研究并不多,落实到物种鉴定和生物地理等的研究更少。目前虽然未见确切的研究结果,但是结合已知的金属污染对鸟类基因多样性的影响(Eevae al,2006)和切尔诺贝利事件以后,动物形态学特征发生的明显变化(Molle&Mousseau,2006),令人联想到线粒体基因是否发生变化的问题,如果变化，这些基因会不会影响本地种群内的序列多样性,或者增加与其他地方同物种种群的核酸序列差异。

第4个问题来自正在快速分化或者形成时间不够长的物种。生物界中有很多瞬间成种的例子:例如鱼类的多倍化成种，如果成种以后时间不够长，它们的线粒体基因是否可以积累足够的差异。目前已知的东非维多利亚湖的丽鱼(cichlid fishes)中，就似乎不适合用线粒体基因区分近缘物种(Verheven el al. ,2003)。

第5个问题来自种间线粒体的基因交流。这种交流最有可能在近缘种间存在，例如，Glemet 综合核基因和多个线粒体基因的数据发现,加拿大某些地区不同种鲑鱼间有线粒体基因交流(Glemetel al,1998),这种现象可能会干扰 COI 基因序列区分物种的能力。还有一些交流是特殊微生物引起的，例如,沃尔巴克氏体引起的种间线粒体基因交流同样会干扰基于线粒体基因的分析(Hurst &Jiggins，2005 )。

最后一个问题来自物种的种内和种间遗传差异之间存在明显界限的设想。这个设想的成立除了把 COI 定为 DNA barcode 需要的一般条件以外，还需要一些附加条件:地理隔离等因素所导致的种内遗传差异局限在一定范围内;近缘种之间最好是交互单系(Mever & Paulay,2005: Ekrem et al.,2007)。近年来,在验证性的研究中已经找到了一些隔离和并系,多系造成的“界线”模糊的案例,例如,宝贝(cowry)(Meyer &Paulay,2005)、蝗虫(grassshop- per)(Trewick,2007)和三代虫(gyrodactylus)(Han sen et al.,2007)。根据这些案例,研究者们提出从2 个方面改进基于 COI 基因的 DNA barcode 方法。第1个改进,建立标准数据库时，同时采用来自不同分布地域,不同种群的样品,尽可能多地把一个物利拥有的单倍型纳入记录,全面反应物种的种内差异，物种鉴定可以通过查找是否有相应的单倍型进行，也可以通过根据已记录单倍型估计的种内差异进行(Mever & Paulay,2005;Ekremet al.,2007)。第2个改进,记录更多的形态,生态信息,综合这些信息和序列比对的结果来进行物种鉴定(Trewick,2007)。