DNA条形码及其在生物多样性研究中的应用

摘要： DNA条形码是利用生物体内标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段对物种进行快速准确鉴定的技术。自2003年DNA条形码相关概念提出以来广受关注，国内外相继开展了DNA条形码及信息系统建设研究，为DNA条形码技术的发展提供了坚实的研究基础和生物信息学分析平台。DNA条形码技术弥补了传统分类学的不足，为生物多样性研究提供了新的思路和方法。本文介绍了DNA条形码的产生与发展过程，国内外DNA条形码技术与信息系统建设研究进展，重点阐述了DNA条形码技术在物种鉴定、濒危物种保护、隐存种发现、生物多样性评估等研究领域中的应用。最后结合DNA条形码技术目前存在的问题，对其在相关研究领域的应用前景进行了展望。

DNA条形码是利用生物体内一段标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段对物种进行快速准确鉴定的技术。该技术极大地增强了人类监测、了解和利用生物多样性资源的能力，其在生命科学、法医学、流行病学，以及医药、食品质量控制等领域均有广泛的应用前景。DNA条形码技术弥补了传统分类学的不足，为生物多样性研究提供了新的思路和方法。本文围绕DNA条形码的产生与发展及其在生物多样性研究中的应用展开论述。

1 DNA条形码的产生与发展

1.1 DNA条形码的定义

生物学研究以准确的物种鉴定为基础，在样品保存良好的前提下，传统分类学家依靠已有的理论知识和实践经验对物种进行鉴定。随着人们对物种鉴定要求的逐步提高，传统形态学鉴定已不能满足相关需要，并且传统形态学鉴定具有一定的局限性，例如：容易忽略类群中普遍存在的隐存分类单元，用作鉴定的特征可能存在表型可塑性及遗传可变性，这些都会导致鉴定错误。而随着传统分类学专家队伍的缩减，能否准确、快速地进行物种鉴定成为分类学必须突破的瓶颈。

对动物界包括脊椎动物和无脊椎动物共11门13 320种的线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome coxidase Ⅰ，COⅠ)基因序列进行比较分析。除刺胞动物Cnidaria外，98%的物种种内遗传距离差异小于1%，很少超过2%，而种间平均遗传距离差异可达到11.3%。应用线粒体COⅠ基因序列鉴定了鳞翅目Lepidoptera 200个近似物种，并提出将线粒体COⅠ基因序列作为全球动物鉴定系统的核心标记基因片段。

同传统的形态学鉴定相比，DNA条形码技术具有以下优势：(1)不受物种发育阶段的影响：以物种DNA序列为检测对象，同种生物在不同生长时期的DNA序列信息一致；(2)操作简单：该技术对研究人员的分类知识与经验要求不高，经过简单培训即可操作，不需要依赖分类学专家；(3)准确性高：每个物种都具有特定的DNA序列信息，利用现有的DNA条形码数据库，可鉴别出全球范围内已收录的所有物种；(4)能够发现传统形态学鉴定所不易发现的新种或隐存种(。目前，DNA条形码技术已经成为生物分类和物种鉴定强有力的工具，在生物多样性保护中得到了广泛的应用。

DNA条形码技术虽然发展前景广阔，但对于保存年代久远的博物馆馆藏标本，要获得其标准的DNA条形码序列比较困难，因其DNA大多已降解。DNA微型条形码(DNA minibarcode)是指长度为100~200 bp的DNA序列，而对于已降解的标本，200 bp左右的序列也可以用于扩增。如的研究表明约130 bp的DNA微型条形码可以有效地被应用于蛾类干制标本的鉴定。设计了1对通用引物Uni MinibarF1/Uni MinibarR1用于扩增COⅠ基因的一段130 bp的片段，在1 866个样本中(包括哺乳类、鱼类、鸟类和两栖类的691种共1 566个样本和植物、真菌、藻类的300个样本)的扩增成功率高达92%。

1.2 DNA条形码的候选基因

动物DNA条形码研究通常选择线粒体COⅠ基因为候选基因，它是一段长度约为650 bp的基因片段，具有长度适宜、进化速率适中等特点，序列的种间差异能较好地区分物种。研究表明，利用COⅠ基因序列能够对北美哥斯达黎加地区1 000多种热带鳞翅目昆虫进行有效的区分；利用线粒体COⅠ基因序列对澳大利亚207种海洋鱼类进行分析，发现COⅠ基因在鱼类鉴定中具有良好的通用性，能够对鱼类进行有效的物种鉴定；在两栖类的条形码研究中，16S rRNA基因和COⅠ基因曾被提出作为适用于两栖类的条形码基因。同COⅠ基因相比，16S rRNA基因高度保守。尽管16S rRNA基因有时也作为两栖类的条形码标记，但在鉴定物种方面没有COⅠ基因有效。利用COⅠ基因和16S rRNA基因鉴定来自小鲵科Hynobiidae的54种130个个体。尽管16S rRNA序列的扩增成功率高于COⅠ基因，但由于其进化速率太慢，不能提供足够的信息从而更有效地鉴定山溪鲵属Batrachuperus、拟小鲵属Pseudohynobius和小鲵属Hynobius的部分物种。重新设计和优化了2对COⅠ通用兼并引物，在中国两栖类的11科36属82种111个个体中进行了验证，证实新设计的2对引物能够较广泛地用于两栖类DNA条形码研究。重新设计了RepCOⅠ-F/RepCOⅠ-R引物，对马达加斯加地区的468种爬行类的扩增成功率高达84.6%，可大规模地应用于爬行类的DNA条形码研究。

植物的DNA条形码研究一般采取的候选基因有matK、rbcL、trnH-psbA、ITS序列。matK基因具有进化速率快、长度适中、种间差异度较高和碱基转换/颠换频率较低等特点。rbcL基因易于扩增，但进化速率较慢，物种间水平变异较小。trnH-psbA基因长度适宜，进化速率快，且该片段的引物通用性好、扩增成功率高，对兰科Orchidaceae植物的识别率高达90%。提出了rbcL＋trnH-psbA基因组合片段的建议，以提高物种鉴别率，结果表明仅采用rbcL基因中的一小段rbcL-a基因在种水平上的识别率为76.3%，trnH-psbA基因的识别率为83%，而将二者结合识别率高达95%。复合序列相较单个序列具有更高的适用性和鉴别力，因此受到研究者的广泛关注。在2007年9月举行的第二次国际生命条形码大会上，与会者提出通过扩增多种片段组合来弥补单位点序列的不足。单独使用matK基因或结合trnH-psbA基因作为条形码对1 600多种植物的基因组DNA进行扩增，识别物种成功率高达90%以上。对7种最常用的单个基因序列进行综合评估，以matK＋rbcL基因组合作为植物通用条形码复合序列，对397个不同科属的样本进行鉴定，成功率达到72%。使用rbcL和matK基因作为DNA条形码，研究了印度热带干旱常绿阔叶林地区114个属的树叶，发现rbcL+matK组合对物种的识别率可高达98%以上。目前植物DNA条形码中rbcL、matK和ITS为核心条形码，trnH-psbA为补充条形码。近年来，也有学者提出将叶绿体全基因组作为“超级条形码”(super-barcode)应用于植物物种鉴定。同传统的DNA条形码(序列长度一般为300~ 700 bp)相比，叶绿体基因组全序列长达110~160 kb，包含足够的变异信息以达到种下等级分辨率的优势，具有更高的分辨率和准确度。随着第二代测序技术的发展和测序成本的降低，已有越来越多植物叶绿体全基因组序列的报道。单分子实时测序技术也开始应用于植物叶绿体基因组测序中。基于叶绿体基因组序列的“超级条形码”进行物种鉴定将受到越来越广泛的关注。

微生物DNA条形码研究中，主要采用ITS基因作为真菌候选基因。国际真菌DNA条形码工作组通过对多个基因序列进行筛选评价，发现了ITS序列可使真菌物种的分辨率达到72%，是目前真菌物种分辨率最高的单一DNA片段。ITS序列是核糖体中的一段DNA片段，包括ITS1、ITS2和5.8S3个常用的DNA序列片段，在真菌和可进行光合作用的真核生物中广泛存在，具有很高的种间差异性。ITS的优点在于片段长度适宜、引物通用性强、便于扩增)。2011年，第四届国际生命条形码大会建议将ITS基因作为真菌DNA条形码的首选。而细菌一般采用扩增16S rRNA基因，该基因具有更易扩增的特点，在原生生物中表现尤为明显。

1.3 DNA条形码的发展

1.3.1 DNA条形码相关的项目和网站

DNA条形码概念自2003年由加拿大生物学家Hebert提出以来发展迅速，许多国家和组织建立了项目和网站。2003年3月，分子生物学家、生物信息学家以及分类学家们在美国召开了“DNA与分类学”主题研讨会，Hebert等提出对全球所有物种的某个基因进行大规模测序，实现物种鉴定。同年9月，在“以分类学DNA与生命条形码”为主题的研讨会上，提出了国际生命条形码计划(International Barcode of Life，iBOL)。iBOL旨在扩大生命条形码数据库(Barcode of Life Database，BOLD)中条形码的地理分布和物种分类信息，同时存储已生成的条形码，提供条形码所代表的信息并确保全球可以共享这些信息。2004年，美国科学家Schindel和Miller发起并成立了生命条形码协会(Consortium for the Barcode of Life，CBOL)，并与美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)建立合作关系，二者将标准的条形码序列和相关信息存档在GenBank中。2009年，国际生命条形码计划启动，来自50多个国家近200多个组织加入并同意把他们的条形码数据公布在公共数据库中。

1.3.2 国际DNA条形码研究

DNA条形码数据库不仅是存储样品信息和DNA条形码序列的工具，也是DNA条形码研究和物种鉴定分析的生物信息学平台，对促进和推动DNA条形码研究发展具有重要意义。2007年5月10日，世界上第一个DNA barcoding鉴定中心——安大略生物多样性研究所(Biodiversity Institute of Ontario)在加拿大圭尔夫大学成立。第一个国际DNA条形码数据系统由CBOL于2007年建立。该系统是生命条形码领域最全面和最有效的数据管理系统，主要功能包括收集、保存、分析和利用世界范围内产生的DNA条形码数据。迄今为止已经有252 961个物种，5 002 427条DNA条形码序列(2016年6月)的相关记录。BOLD中不但收集DNA条形码序列数据，还规范了有关物种分类、样品采集、标本保存、标本图片和测序质量文件等要求。iBOL得到很多国家和地区的支持，共建立了3种不同类型的节点，包括国家、地区和中心节点。亚太地区共7个国家参与构建(中国、澳大利亚、印度、韩国、俄罗斯、新西兰和巴布亚新几内亚)，其中，中国为中心节点；俄罗斯为地区节点；巴布亚新几内亚为国家节点。2010年1月在日本名古屋召开的《生物多样性公约》第十次缔约方会议(The 10th Conference of the Parties to the Convention on Biological Diversity，CBD-COP10)上，iBOL与CBD正式缔结合作关系。全球分类计划(Global Taxonomic Initiative，GTI)提出将DNA条形码作为一项完善分类学的工具(www.cbd.int/decision/cop/?id=12305)。此外，国际上还有多个针对特定动物类群的条形码数据库，例如：哺乳动物生命条形码行动(Mammalia Barcode of Life Campaign；www.mammali-abol.org)，该行动旨在构建一个面向全球哺乳动物的综合性DNA参考文库；鳞翅目生命条形码(Lepidoptera Barcode of Life；lepbarcoding.org)旨在构建全部蚜虫和蝶类物种的COⅠ条形码文库；鱼类生命条形码行动(Fish Barcode of Life Campaign；www.fishbol.org)旨在收集30 000种以上世界范围内鱼类的条形码，且每个物种至少包括5个标本；欧盟检疫性有害生物DNA条形码数据库Q-bankife，是由荷兰植病专家Peter Bonants发起并联合欧盟成员国科研人员，针对欧盟检疫性有害生物建立的DNA条形码信息系统，能对昆虫、入侵植物、细菌、真菌等有害生物进行检疫。

1.3.3 我国DNA条形码数据库建设与项目研究

中国生命条形码信息管理系统由中国科学院微生物研究所自主开发，迄今收录了47 914个样本，总计55 225条序列。该系统收录来源于BOLD的所有公开数据，可以便捷地获取来源于BOLD的公开数据，并管理自己的DNA条形码数据，为DNA条形码数据在世界范围内的数据共享做出了贡献。中国检疫性有害生物DNA条形码信息系统于2012年正式对外开放，由凭证标本库、数字标本库和DNA条形码数据库组成。DNA条形码系统架构在Linux+TomcaLinux+Tomcat+PostgreSQL的平台上，平台服务器的操作系统是Linux，网站服务平台是Tomcat，数据库服务平台是PostgreSQL。系统是基于JAVA语言的SSH(Struts+Spring+Hibernate)框架开发的。2013年12月，由中国科学院植物研究所构建的“中国珍稀濒危植物DNA条形码鉴定平台”(www.brep.ac.cn)正式启用，这是一个社会公益性平台，目的是让全社会能利用科学研究成果。该平台提供多种DNA条形码鉴定途径，达到准确鉴别未知珍稀濒危植物的目的。2015年11月5日，由中国科学院昆明动物研究所开发的“中国两栖类信息系统”正式上线，标志着中国两栖类物种有了属于自己的DNA条形码数据库，该信息系统共收录中国两栖类物种3目12科61属429种，对每一个物种都进行了专业介绍。该系统还可进行“在线物种鉴定”，后台数据库已包含2 048条COⅠ基因序列，覆盖302个物种。

此外，我国还大力开展了许多DNA条形码项目研究，例如2012年启动的“十二五”“863”计划、“基于DNA条形码的快速检测与分类关键技术”，通过选择我国珍稀药用物种资源、野生物种资源、主要农作物资源和环境指示型生物等，来研制DNA条形码检测技术和相关试剂产品，并构建上述生物物种的基因条形码标准数据库，建立我国重要生物遗传资源的DNA条形码网络服务体系及基于DNA条形码技术的快速检测方法和分类平台。中华人民共和国科学技术部国家科技基础性工作专项——“我国重要渔业生物DNA条形码信息采集及其数据库构建”重点项目于2013年6月启动，旨在拓展DNA条形码技术在渔业新资源开发、种质资源评价、水产育种、水产品质量安全和有害入侵物种控制等方面的应用。迄今为止已经建立了具有渔业生物特色的DNA条形码技术；采集并保存了渔业生物标本11 067份，获得渔业生物DNA条形码2 447条，建立了初具规模的渔业生物凭证标本库和DNA条形码数据库；工作专项——“《中国植物志》的数字化和DNA条形码”于2013年11月启动，以《中国植物志》、Flora of China和中国高等植物物种信息等研究成果 为核心，将植物分类学以及相关学科的最新研究成果整合，利用计算机和现代网络信息技术集成传统分类、分子系统学和DNA条形码等信息，更新和提升数字化的《中国植物志》，构建网络协同工作平台，初步实现我国维管植物科属级水平鉴定信息系统，构建新一代智能植物志(iFlora)；2014年启动的工作专项——“我国近海海洋生物DNA条形码资源库构建”由中国科学院海洋研究所承担，根据不同类群的特点，选择有代表性的重要海洋生物类群，如原核生物、植物、浮游动物、大型底栖无脊椎动物及鱼类等，在形态学准确鉴定的基础上，系统并规模化地获取DNA条形码序列。国家自然科学基金委员会重大项目——“DNA条形码标准基因的进化和隐存生物多样性研究”，基于DNA条形码序列探索新种和隐存种的理论和方法，通过筛选新的动物DNA条形码标准基因，研究标准基因的变异规律，为不同动物类群标记基因的选取及设计提供理论依据。

2 DNA条形码在生物多样性研究中的应用2.1 生物多样性保护2.1.1 物种鉴定

随着经济的发展，珍稀濒危物种栖息地日益遭到破坏，对生物多样性的保护刻不容缓。开展濒危物种的保护研究首要任务就是对物种进行准确鉴定。DNA条形码技术结合形态学鉴定更为准确客观对中国境内分布的啮齿目Rodentia鼠亚科Murinae和田鼠亚科Arvicolinae部分物种进行首次大规模系统的DNA条形码鉴定研究。该研究分析了四川地区鼠亚科31个种和田鼠亚科23个种的线粒体COⅠ基因片段，发现DNA条形码可以准确识别物种并可以完善系统的啮齿目物种鉴定工作。但是其中一种BLOG数据分析方法需要建立在正确的形态学鉴定的基础上，对物种的鉴定成功率才能达到100%，这表明在DNA条形码研究中对物种进行完全的分类和准确的形态学鉴定同样重要。形态学鉴定粉虱(Hemiptera：Aleyrodidae)成虫很困难。Ovalle等分析了9种若虫阶段和成虫阶段的粉虱COⅠ基因序列(约709 bp)，发现DNA条形码技术可以实现对粉虱的快速鉴定，当结合限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)技术时可以节省测序费用并充分区分不同粉虱之间的变异，更有效地监控粉虱的传播。

DNA条形码不仅被成功应用于动物物种鉴定，在植物鉴定中也发挥较大作用。Pei等和裴男才利用DNA条形码从热带雨林或亚热带常绿阔叶林中一些林冠层物种的叶片或树皮中提取DNA，能够对相关物种进行快速准确鉴定。Xie等(2014)将DNA条形码技术应用于中国74种有毒植物，使用生物信息学分析方法评估matK、rbcL和ITS序列对植物的辨识度，证明DNA条形码技术是一种可以快速鉴定有毒植物的方法，并建议matK、rbcL和ITS 3种基因结合作为DNA条形码技术鉴定有毒植物的条形码基因。Naeem等(2014)通过棕榈科中10个物种的叶片样本评估matK和rbcL基因对棕榈科植物的鉴别，结果表明这2种条形码基因均显示出较高的扩增成功率，基于matK基因对棕榈科植物的鉴别力高达90%，比rbcL基因(66.6%)更适合作为棕榈科植物鉴定的标准条形码。

2.1.2 濒危物种的保护

DNA条形码技术准确、快速的特点使其能够有效地被应用于濒危物种的保护。Holmes等(2009)对澳大利亚附近海域非法捕捞的不明来源的211个鱼鳍样品进行物种鉴定，发现多数鲨鱼属于被列为世界自然保护联盟(IUCN)红色名录的鼬鲨属Galeocerdo、真鲨属Carcharhinus、柠檬鲨属Negaprion，还发现样品中包括极度濒危物种——钝锯鳐Anoxypristis cuspidata。DNA 条形码作为一种快速简便的识别鉴定方法在濒危植物的保护中也得到较好的应用。Zuo等(2011)为了鉴别濒危物种人参属Panax的物种，使用DNA条形码技术对人参属8种的95个样本进行研究：基于11个候选基因(atpF-atpH、trnH-psbA、psbK-psbI、psbM-trnD、matK、rps16、rpoB、rpoC1、rbcL、nad1、ITS)片段的序列分析，发现trnH-psbA和ITS基因组合足以鉴别人参属的所有物种。Sosa等评价不同条形码基因对墨西哥20种濒危兰科和36种竹亚科Bambusoideae植物的鉴别力，结果表明仅使用matK基因即可对墨西哥濒危兰科植物鉴定到种，而使用psbI-K基因结合matK基因可对竹亚科植物鉴别到属。

2.1.3 发现隐存种

传统的分类鉴定方法并不能够准确地揭示种群之间的遗传分化，而DNA条形码不受主观判断影响的限制，不仅可以揭示物种之间的遗传分化，还能发现新种与隐存种，有利于生物多样性的保护。Saitoh等基于线粒体COⅠ基因序列分析了日本列岛的234种鸟和欧亚大陆的142种鸟，发现日本列岛及其周边的24种鸟类可能是隐存种，这与日本列岛周围的海洋和海峡的基因阻隔作用有关。该研究表明传统的鸟类分类方法在对东亚鸟类进行鉴别时不能完全反映其中的差异性，而COⅠ基因在鉴定鸟类时具有很高的分辨率，可以成为鉴别鸟类物种的有效工具。Efe等用线粒体COⅠ、Cytb等基因对濒危物种——白嘴端燕鸥Thalasseus sandvicensis进行研究，发现了该种鸟类的2个隐存种，为保护该珍稀鸟类提供了新方向。Liu等(2011)基于植物DNA条形码的5个候选基因(rbcL、matK、trnH-psbA、trnL-F、ITS)对分布于欧亚的11种红豆杉属Taxus植物进行了研究，研究表明单独使用ITS、trnL-F基因或组合可以作为鉴定最可靠的条形码，同时确定了欧亚的红豆杉属植物可能存在隐存种。这一结论也得到了居群遗传学和形态学的支持。Lahaye等在使用8种条形码对中美洲和南美洲的1 600多种植物进行分析时不仅证明了DNA条形码在生物多样性中的适用性，而且在使用matK基因进行数据分析时发现其中一种捧心兰Lycaste cf. tricolor可能存在隐存种。

2.2 生物多样性评估

DNA条形码技术也是开展生物多样性评估和物种鉴定研究有效的工具。传统的蝙蝠生物多样性野外调查主要依赖于形态学上的鉴定和蝙蝠探测器装置的使用，但传统的鉴定方法耗时耗力，而且蝙蝠探测器无法对特定物种进行监测造成资源浪费。Wilson等(2014)在缺乏物种信息的情况下，基于线粒体COⅠ基因序列对翼手目4属(Rhinolophus、Hipposideros、Murina、Phoniscus)的13个个体进行物种鉴定，发现DNA条形码可以完全区分这13种翼手目动物，更加准确地评估ɑ多样性和β多样性。Chen等收集怒江流域46种形态不同的1 139个鱼类个体，通过NJ树、条形码指数(Barcode Index Numbers，BINs)、间隙条形码发现(Automatic Barcode Gap Discovery，ABGD)等方法鉴定出43个物种，并且发现在棒花鱼Abbottina rivularis、高体鳑鲏Rhodeus ocellatus、大鳞副泥鳅Paramisgurnus dabryanus这3个入侵物种的种内可能存在隐存种。

DNA条形码技术不仅可以对当前的生物多样性进行分析，也可以对过去的生物多样性进行分析。Willerslev等对从格兰陵岛冰帽底部收集到距今约45万年的粉末状样品进行分析，发现格兰陵岛南部在那时有森林覆盖，植被主要由云杉属Picea、桤木属Alnus、松属Pinus组成。此外，DNA条形码技术还能作为了解生物体之间营养相互作用的工具，尤其是难以进入的栖息地，如森林根冠及地下区域。Jones等(2011)对巴拿马巴罗科罗拉多岛热带雨林的土样进行收集，利用DNA条形码鉴定根的种类，通过将在DNA条形码基础上对根的鉴定和树木个体空间的记录结合起来，得出的结论反映了植被之间的关系，并能够据此重建植物群落的地上与地下关系。

随着第二代测序技术的发展，基于DNA条形码技术水平上的生物多样性分析更为经济方便。整合了DNA高通量测序和DNA条形码技术的DNA metabarcoding技术，通过提取环境样品中的DNA，并使用特异性引物进行PCR扩增，对扩增产物测序后得到的操作分类单元(operational taxonomic units，OTUs)进行物种鉴定。该技术具有准确性高、成本低、对所取样品量要求低等优点，在食性分析、物种监测、外来入侵物种的监测方面得到了较广泛的应用，也为生物多样性评估提供了高效有力的分析方法。Thomsen等利用环境DNA metabarcoding技术研究海洋鱼类生物多样性，在获得的环境DNA中发现了15种不同的鱼类以及4种鸟类，其中包括一些用传统监测方法很难发现的稀有物种。与9种传统的海洋鱼类调查方法比较，环境DNA检测出的鱼类多样性与其他传统方法相当，甚至优于传统方法。Evans等使用环境DNA metabarcoding技术对模拟条件下的水体生态群落进行研究，发现物种丰富度和测序读长丰富度存在正相关关系，表明环境DNA metabarcoding技术在量化自然环境水体中的物种多样性上有很大潜力，并且该技术可作为衡量大型底栖动物丰富度的指数。最近，Crampton-Platt等基于第二代测序技术对来自婆罗洲雨林的500个甲虫标本的混合样品进行测序，获得175个物种的全部或部分线粒体基因组。利用这些样本分析获得的系统进化树与基于全球鞘翅目Coleoptera主要支系现有的线粒体基因组构建的系统进化树高度相似。结果表明线粒体宏基因组可作为新的DNA“超级条形码”用于研究节肢动物及其他生物多样性的全球模式。

3 展望

鉴于单基因在类群中通用性不高的因素，多基因片段联合的DNA条形码鉴定系统已经成为一个探索的趋势。随着DNA metabarcoding、DNA微型条形码、宏条形码等的发展，以及DNA条形码数据库的不断完善，DNA条形码技术将在生物多样性研究领域得到更广泛的应用。

在出入境检验检疫以及鉴定外来入侵物种等方面，传统形态学鉴定需要花费大量时间，很难进行快速检疫，DNA条形码技术为检验检疫及鉴定外来入侵物种提供了新的工具。2011年，“基于DNA条形码的快速检测与分类关键技术”被纳入中国高技术研究发展计划(“863”计划)。其次，DNA条形码技术在中药材鉴定中也有着广阔的应用前景，能够对药材真伪进行鉴定，在生物监管领域具有广泛的应用空间。使用DNA条形码技术不但能在栖息地丧失之前创建生物多样性的库存，而且有助于生物多样性的保护。DNA条形码鉴定具有快速、简便、不受外界环境变化而改变等优势，随着测序技术的迅速发展，鉴定成本不断下降，相信在未来将会具有更广泛的应用。

DNA条形码技术的发展给生物学研究带来了许多机遇，但尚未解决自身局限性所带来的问题，比如核内假基因的存在会导致DNA条形码进行物种鉴定时出现错误，使用通用引物对DNA进行条形码扩增时，这些假基因会协同扩增进而导致对物种数量估计过高。Song等(2008)利用蝗虫和小龙虾研究了假基因对DNA条形码鉴定产生的影响，发现假基因导致条形码过高估计了物种数目。此外，近缘物种间的杂交或基因渗入及某些新近形成物种序列差异极小等问题会导致线粒体基因没有积累足够的变异来区分物种(戴传银等，2010)。Ermakov等(2015)发现欧亚大陆地区的4种黄鼠(Spermophilus fulvus、S. major、S. pygmaeus和S. erythrogenys)存在线粒体DNA基因渗入，例如在S. fulvus中发现有16.6%个体有S. major的单倍型，5%的S. pygmaeus个体有S. fulvus的单倍型，COⅠ基因的单倍型有不同程度的重叠，无法正确鉴定这4个物种。Feng等(2013)应用DNA条形码鉴别中国西部的杨属Populus L.物种，结果发现DNA条形码对那些分布区重叠或是相邻区域的物种无法鉴别，这可能是由于种间杂交或基因渗入、不完全谱系分选(incomplete lineage sorting)导致。

DNA条形码技术同样面临着取样问题，研究表明地理分布较远的同种生物因共生体的不同会导致线粒体DNA序列的差异变大，出现一个物种具有多个不同的条形码(Ingleby et al.，2013)。研究过程中取样的数量也会对鉴定结果产生影响。此外，存在足够大小的条形码间隙(barcoding gap)是DNA条形码准确鉴定物种的前提之一。而随着技术的发展与研究的深入，已发现条形码间隙在有些类群中并不明显，甚至出现了种内差异和种间差异重叠的现象。同时，在DNA条形码研究过程中应严格遵循综合分类学(integrated taxonomy)的理念。